laporan biomolekul

 Penentuan kadar karbohidrat dan gula reduksi pada buah pepaya

Karbohidrat merupakan suatu polihidroksi aldehid atau polihidroksi keton dan meliputi kondensat polimer-polimernya yang terbentuk. Karbohidrat memiliki rumus empiris CnH2nOn¬. Karbohidrat banyak terdapat dalam bahan nabati, baik berupa gula sederhana ataupun karbohidrat dengn berat molekul yang tinggi. Karbohidrat merupakan sumber kalori yang utama bagi mahluk hidup (Anonim, 2010).
Secara alami, terdapat tiga bentuk karbohidrat yang terpenting, yaitu monosakarida, oligosakarida (terdiri atas 2-10 unit monoskarida), dan polisakarida (terdiri lebih dari 10 unit monosakarida). Contoh monosakarida adalah glukosa. Contoh oligosakarida adalah sukrosa. Contoh polisakarida adalah pati, amilum, selulosa, pektin, gum. Karbohidrat sebagai polihidroksi aldehid atau polihidroksi keton mempunyai kemampuan untuk mereduksi suatu senyawa. Sifat reduktif ini terdapat pada gugus hidroksil atom C nomor 1 untuk aldosa dan pada atom C nomor 2 untuk ketosa
Ada banyak cara yang dapat digunakan untuk menentukan kandungan karbohidrat dalam bahan pangan, misalnya dengan cara kimiawi, fisik, enzimatis, biokimia, maupun kromatografi. Penentuan kandungan karbohidrat dengan cara kimia didasarkan pada reaksi oksidasi cupri menjadi cupro. Metode penetapan secara kimia meliputi: luff schoorl , munson-walker, lane eynon , nelson-somogy , Oksidasi ferri ,Iodometri (Sukatiningsih, 2010). Analisa karbohidrat dapat dilakukan terhadap kandungan total karbohidrat, kandungan total gula, kandungan pati, serat kasar, serat pangan, dan senyawa pektin. Semua senyawa karbohidrat tersebut dapat menentukan nilai gizi pangan bahan sumber karbohidrat.
*PENETAPAN PATI*
Pati merupakan molekul polisakarida yang terdiri dari amilosa dan amilopektin dimana kedua unsure penyusun pati ini merupakan rantai dari molekul glukosa dan apabila dihidrolisa menghasilkan glukosa dan amilosa. Dengan larutan iodium amilosa akan berwarna biru, sedangkan amilopektin akan berwarna violet. Pada umumnya pati tidak terdapat dalam keadaan murni, tetapi tercampur dengan zat-zat lain. Oleh karenanya didalam analisa kimia kadar pati, zat-zat lain itu harus dipisahkan agar analisanya sempurna. Pinsip analisanya yaitu hidrolisa pati oleh asam atau enzim sehingga diperoleh kadar pati. Kadar pati dalam sample sama dengan 0,9 kali kadar gula reduksi dalam sample (Fardiaz, 1989).
Pada praktikum kali ini dilakukan analia penetapan pati dengan menggunakan metode Nelson-Somogi. Prinsip kerja metode Nelson-Somogi yaitu tereduksinya jumlah endapan kuprooksida yang bereaksi dengan arsenomolibdat yang tereduksi menjadi molybdine blue dan warna biru diukur absorbansinya. Reagen Nelson berfungsi sebagai oksidator antara kuprooksida yang bereaksi dengan gula reduksi membentuk endapan merah bata.
Pada penentuan kadar pati terlebih dahulu dilakukan perparasi sampel, hal ini dimaksudkan untuk mendapatkan sample yang benar-benar murni. Perlakuan pertama adalah dengan mengambil 2 gram sample (pepaya) lalu ditambahkan aquadest untuk melarutkan sample. Lalu distirer selama 1 jam yang berfungsi untuk menghomogenkan larutan dan memisahkan larutan dari komponen selain karbohidrat. Kemudian disaring dan diambil filtratnya atau padatannya dan dicuci dengan aquadest untuk mempermudah ekstraksi pati dari bahan. Residu yang dihasilkan dicuci dengan eter untuk menghilangkan lipida dan klorofil yang terkandung dalam bahan. Setelah itu residu dicuci lagi dengan etanol 10% untuk melarutkan lemak yang masih terkandung dalam sample dan untuk mencegah terjadinya hidrolisa gula oleh
enzim. Hasil residu yang diperoleh kemudian dipindahkan secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam Erlenmeyer, setelah itu dicuci dengan aquadest dan ditambahkan 25% HCl untuk menghidrolisa pati dan memecah residu menjadi amilosa dan amilopektin. Lalu panaskan pada pemanas balik yang berfungsi untuk menghidrolisa pati sehingga volumenya tetap selama 2,5 jam. Setelah itu didinginkan, kemudian dinetralkan dengan NaOH 45% pada pH 7 untuk mengembalikan pH larutan akibat pengaruh asam pada hidrolisa pati. Hasil yang diperoleh kemudian diencerkan hingga volume 500 ml, lalu disaring dan diambil filtratnya sebagai sampel.
Filtrate sample dimasukkan ke dalam tabung dengan junlah yang berbeda-beda (25µl, 50µl dan 75µl) serta blanko yang berisi aquadest, ditambahkan reagen Nelson, setelah itu dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit. Reagen Nelson berfungsi sebagai katalisator yang mereduksi kuprioksida menjadi koprooksida karena adanya gula reduksi yang berwarna merah bata. Jumlah endapan kuprooksida eqivalen dengan julah gula reduksi yang ada. Kemudian larutan ditambahkan Arsenomolybdat yang akan bereaksi dengan kuprooksida membentuk molybdine pada panjang gelombang 540 nm yang dapat menyerap optimum.
*GULA REDUKSI*
Gula reduksi adalah monosakarida yang mempunyai kemampuan untuk mereduksi suatu senyawa. Sifat pereduksi dari suatu gula ditentukan oleh ada tidaknya gugus hidroksil bebas yang reaktif. Prinsip analisanya berdasarkan pada monosakarida yang memiliki kemampuan untuk mereduksi suatu senyawa. Adanya polimerisasi monosakarida mempengaruhi sifat mereduksinya (Baedhowie, 1982).
Pada praktikum kali ini dilakukan penetapan karboohidrat melalui penetapan kadar gula reduksi dengan metode… Penentuan gula reduksi dengan metode Luff-Schoorl ditentukan bukan kuprooksidanya yang mengendap tetapi dengan menentukan kuprooksida dalam larutan sebelum direaksikan dengan gula reduksi sesudah reaksi dengan sample gula reduksi yang dititrasi dengan Na-Thiosulfat. Selisihnya merupaka kadar gula reduksi. Reaksi yang terjadi selama penentuan karbohidrat dengan cara Luff-Schoorl adalah mula-mula kuprooksida yang ada dalam reagen akan membebaskan Iod dari garam KI. Banyaknya iod dapat diketahui dengan titrasi menggunakan Na-Thiosulfat. Untuk mengetahui bahwa titrasi sudah cukup maka diperlukan indicator amilum. Apabila larutan berubah warna dari biru menjadi putih berarti titrasi sudah selesai. Selisih banyaknya titrasi blanko dan sample dan setelah disesuaikan dengan tabel yang menggambarkan hubungan banyaknya Na-Thiosulfat dengan banyaknya gula reduksi (Sudarmadji, 2000).
Reaksi yang terjadi adalah :
R – COOH + CuO Cu2O + R – COOH
Cu2O + arsennomolybdat molybdine blue
Untuk menentukan kadar gula reduksi, pertama- tama ilakukan preparasi sample. Sebelum dianalisa bahan dipisahkan atau dikupas terlebih dahulu untuk membebaskan bahan dari zat pencampur. Pertama-tama diambil 1 gr sampel dan dimasukkan ke dalam beaker glass. Kemudian tambahkan aquades sebanyak 75 ml untuk melarutkan bahan dan untuk mempermudah ekstraksi gula reduksi dan stirer selama 15’ agar larutan benar-benar tercampur dan homogen. Tambahkan 1 gr CaCO3 agar selama penghilangan zat-zat pencampur tidak terjadi inversi dan hidrolisa dari sukrosa oleh asam-asam organik yang ada dalam bahan. Kemudian panaskan selama 30’ untuk melarutkan asam-asam organik yang terdapat dalam sampel dan juga mempercepat terjadinya reaksi. Dinginkan dan saring sehingga diperoleh filtrat. Tambahkan BaOH untuk memisahkan endapan dan cairan dan ZnSO4 untuk menjernihkan.kemudian saring dan tera sebanyak 100 ml sampai diperoleh filtrate sampel. Beberapa perlakuan dalam penetapan gula reduksi berdasarkan metode ini adalah dengan menyiapkan 3 tabung dengan jumlah volume sampel yang berbeda-beda. Ambil masing-masing (25µl, 50µl dan 75µl) dan tambahkan 1 ml Nelson (25 A + 1B) yang berfungsi sebagai oksidator yang dapat mengalami reduksi dari kuprioksida dengan gula reduksi menjadi kuprooksida yang terbentuk ekuivalen dengan banyaknya gula reduksi yan ada dan panaskan selama 20’. Pemenasan berfungsi untuk mempercepat terjadinya reaksi. Setelah itu dinginkan dan tambahkan 1 ml arsennomolybdat dan aquades hingga 10 ml. Hasil reaksi dengan Arsennomolybdat akan mengalami reaksi menjadi molybdine blue yang membentuk senyawa kompleks warna biru. Tambahkan aquades untuk melarutkan sampel. Kemudian vortex dan absorbansi pada panjang gelombang 540 nm yang merupakan panjang gelombang optimum sampel tersebut. Selain itu juga dibuat kurva standart yaitu dengan cara menggunakan larutan glukosa standart dengan volime pengambilan 0 – 900 µl, kemudian ditambah dengan 1 ml reagen Nelson lalu dipanaskan selama 20 menit. Setelah dingin, kemudian ditambah denga arsenomolybdat sebanyak 1 ml dan ditambah dengan aquadest hingga 10 ml. Kemudian divortex dan diukur absorbansinya pada panjang 540 nm. Kurva standart yang diperoleh mempunyai tujuan yaitu untuk mengetahui besarnya konsentrasi sample dengan mudah. Kurva standart yang diperoleh merupakan hubungan antara nilai absorbansi larutan glukosa sebagai sumbu Y dan volume dalam mg glukosa sebagai sumbu X. Selanjutnya diperoleh persamaan linier sebagai persamaan kurva standart yang dapat digunakan untuk menentukan kadar gula reduksi dan kadar pati.

1. Cara Kerja

• Pemilihan sampel

1. Dipilih pepaya yang permukaan kulitnya harus rata, halus dan tidak cacat
2. Warna kulit dari hijau, kuning dan merah
3. Permukaan kulit dicuci agar bebas dari kotoran

• Persiapan sampel

1. Bahan dipotong dengan ukuran (p x l x t) 4 x 3 x 4 cm,
2. Bahan difoto (intensitas cahaya dan jarak sama) pada permukaan kulit dan daging
3. Bagian kulit diiris dengan ketebalan 0,5 cm
4. Masing-masing ditimbang
5. Masing-masing irisan diekstrak

• Ekstraksi Pigmen

• Preparasi sampel pigmen

1. Ditimbang dengan teliti 5 gram kulit pepaya yang telah dipersiapkan
2. Bahan diparut dan dihaluskan dalam mortar secara cepat
3. Ditambahkan 5 ml petroleum eter dan 5 ml aseton dan digerus terus secara cepat
4. Dimasukkan larutan kedalam labu takar
5. Diulangi pekerjaan ini 3 kali masing-masing menggunakan 4 ml petroleum eter dan aseton
6. Ditambahkan petrolium eter dalam labu ukur 25 mL hingga tanda batas
7. Dilakukan diruang gelap atau labu takar yang dibalut dengan kertas karbon.

• Persiapan Kolom kromatografi

1. Bagian bawah buret disumbat dengan glass wool
2. Diisi bubuk aluminia setinggi 10 cm
3. Diisi natrium sulfat anhidrit setinggi 10 cm.
4. Kolom tersebut dipasang vertikal pada statif
5. Disiapkan erlenmeyer dibagian bawah kolom (untuk menampung cairan yang keluar dari kolom)

• Ekstraksi pigmen dengan kolom kromatografi

1. Dimasukkan 10 ml ekstrak pigmen kedalam kolom kromatografi
2. Setelah ekstrak pigmen dalam kolom habis dimasukkan petrolium eter kedalam kolom sampai larutan keluar dari kolom dan ditampung sampai warna tersebut habis
3. Jika ada warna yang lain diganti penampungnya sampai warna tersebut habis
4. Masing-masing eluat dalam erlenmeyer ditambahkan petrolium eter ke dalam labu ukur 25 mL sampai tanda tera
5. Eluat disaring dengan kertas saring
6. Eluat tersebut disimpan dalam botol kecil yang dilapisi kertas karbon dan disimpan dalam kulkas
7. Endapannya disimpan
8. Eluat yang mengandung pigmen dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400-700 nm

• Analisa Karbohidrat

• Preparasi sampel

1. Daging buah ditimbang sebanyak 5 gram
2. Sampel diparut dan digerus dalam mortar dan tambah alkohol 98% sedidikit demi sedikit sebanyak 20 mL
3. Selanjutnya dipindahkan ke dalam beaker gelas dan tambah etanol sampai 50 ml
4. Dipanaskan dalam penangas dengan suhu 70 derajat 10 menit
5. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dengan kecepatan minimum 2000 rpm selama 10 menit
6. Hasil sentrifus ada tiga bagian yaitu bagian mengendap, bagian cair dan bagian yang terapung
7. Bagian yang terapung di buang
8. Bagian yang cair ditambahkan larutan Pb-asetat 10% sebanyak 2 ml
9. Disentrifus lagi dan dipisahkan supernatannya
10. Endapan yang didapat ditambah 20 ml campuran etanol absolute : air (80:20) dan disentrifus
11. Supernatannya digabung dengan supernatan yang didapat sebelumnya
12. Gabungan supernatan diuapkan dengan penangas air sampai volume 10 ml.
13. Kelebihan Pb-asetat dihilangkan dengan menambahkan Na-oksalat 5% sampai tidak terjadi endapan
14. Larutan dimasukkan kedalam labu takar 25 ml lalu ditambahkan etanol absolut : air (80:20) sampai tanda batas
15. Dikocok sampai homogen dan disaring
16. Siap dianalisis dengan metoda Nelson
17. Bagian endapan dicuci sampai 3 kali dengan etanol
18. Hasil pencucian dikeringkan dalam oven selama 2 jam
19. Endapan dicampur dengan endapan hasil analisis pigmen
20. Timbang lagi

• Pembuatan larutan standar untuk kurva regresi

2. Disiapkan 5 tabung reaksi kering dan bersih
3. Masing-masing tabung disi satu larutan standar dengan konsentrasi 0,02; 0,04; 0,06 dan 0,08
4. Masing-masing larutan standar ditambahkan larutan Nelson 1 mL dan panaskan 7 menit
5. Didinginkan sampai suhu kamar
6. Masing-masing larutan standar ditambah 1 ml arsenomolibdat
7. Masing-masing di ukur intensitas cahaya serapnya

• Uji gula reduksi

1. Larutan sampel ditambahkan larutan Nelson 1 mL
2. Dipanaskan selama 7 menit
3. Didinginkan sampai suhu kamar
4. Ditambahkan 1 mL arsenomolibdat
5. Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL sebanyak 1 ml
6. Diencerkan dengan aquades sampai tanda batas
7. Dimasukkan kedalam tabung reaksi

• Teknik pengukuran 1 serapan

1. Kuvet dicuci bersih sampai tidak kelihatan bintik air (bagian dalam kuvet jangan dilap denga tisu)
2. Bagian luar dilap satu arah
3. Masukan sampel dalam kuvet sampai ¾ tinggi kuvet
4. Kuvet bagian luar dilap lagi dan jangan disentuh tangan langsung

• Analisa Foto

1. Alat yang digunakan program image matrix
2. Buka file matrik
3. Tekan File matrix_color
4. Dicari foto dalam folder
5. Ditekan tombol RGB atau keabuan
6. Hasil proses diletakan pada folder tertentu
7. Dibuka hasilnya berupa sebuah matrik
8. Angka yang sama menunjukan intensitas yang sama
9. Data dioleh dengan konsep Hukum “BEER_LAMBERT”